延安细胞迁移实验***系统模型「英瀚斯」

小鼠精原gan细胞分离富集和培养

成年小鼠gao丸中约有108个细胞,其中约有 2×104个是精原gan细胞,仅占gao丸生精上皮细胞总数的 0.02～0.03%,精原gan细胞数量太少不利于体外培养.分离和富集精原gan细胞成为精原gan细胞体外培养能否成功的前提条件.寻找分离和富集小鼠精原gan细胞有效方法. 方法:出生6-8天小鼠为实验对象,先用0.25%胰酶1mM EDTA消化gao丸10min,用胎牛xue清终止消化,用一次40-um孔径的滤器过虑制成单 细胞悬液,30%percoll不连续密度梯度法离心富集精原gan细胞,再根椐未分化精原gan细胞表面thy1.2(CD90.2)阳性CD117(c- kit)阴性特点用流式细胞仪将精原gan细胞分选出来,并在体外进行培养尝试. 结果:30%percoll密度梯度离心前CD117(c-kit)阳性细胞占13.80±3.34%,CD90.2阳性细胞占28.98±4.51%, 二者都阳性细胞占8.98±2.98%,CD117阴性CD90.2阳性细胞占18.36±2.67%;离心后 CD117(c-kit)阳性细胞占12.37±3.34%,CD90.2阳性细胞占56.98±4.51%,二者都阳性细胞占 8.20±3.98%,CD117阴性CD90.2阳性细胞占32.36±3.67%;CD117(c-kit)阳性细胞和二者都阳性细胞所占百分比前后 比较差异无显著性(P>0.1),CD90.2阳性细胞和CD117阴性和CD90.2阳性细胞所占百分比前后比较差异有显著性 (P<0.05);采用CD117和CD90.2作为标志分子,percoll离心后细胞悬液经FACS分选后获得细胞纯度

细胞培养中常见的污染及解决方法

真菌污染

真菌污染后，培养基一般清澈，保持原色。细丝可以在显微镜下观察到。5ml生物素化抗ti（Bio-Ab）（2μg/ml），37℃孵育1h或4℃过夜，弃掉液体，PBS-T洗涤3次，每次3min。，一些真菌类似于死细胞碎片，但其中许多清晰可见，看起来像珊瑚，比较容易区分。此外，它们会慢慢长出细细的黑色细丝，因为它们生长得比较慢，不像细菌那样容易被发现，一旦发现培养基被污染，它们将很难存活。

解决方法：一旦被真菌污染，果断丢弃，然后对细胞房、CO2 培养箱、器皿和培养基进行消毒。

细胞冻存有哪些注意事项？

细胞培养的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费，而且细胞一旦离开开始原代培养，它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。因此及时进行细胞冻存十分必要。(7)24小时后弃去培养液(看细胞贴壁情况)，PBS冲洗2-3次去除末贴壁细胞，加入培养液继续培养。细胞冷冻储存在-70℃冰箱中可以保存一年之久;细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是的。

细胞冻存的步骤：

配制含 10%DMSO 或甘油、10~20% 小牛的冻存培养液;

取对数生长期的细胞，去除旧培养液，用 PBS 清洗。

去除 PBS，加入适量胰蛋白酶 (覆盖培养皿表面) 把单层生长的细胞消化下来;

离心 1000rpm，5min;

去除胰蛋白酶，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的终密度为 5×106/ml~1×107/ml;

将细胞分装入冻存管中，每管 1~1.5 ml;

在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者;

冻存:标准的冻存程序为降温速率-1~-2℃/ min;当温度达-25℃以下时，可增至-5℃~-10℃/min;到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。G，过表达慢病毒系统使用pLVX-AcGFP、psPAX2、pMD2。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱 2h ，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。