新疆细胞实验***系统模型 英瀚斯

自噬(autophagy)是细胞受到刺激后吞噬自身的细胞质或细胞器，终将吞食物在溶酶体内降解的过程,自噬体(autophagosome)为双层膜包被的圆形或椭圆形结构,内含细胞质、长寿蛋白质和异常蛋白聚集物，损伤或多余细胞器如线粒体、粗面内质网和微体、

病毒和细菌等。单丹磺酰尸胺(Dansylcadaverine,MDC是一种荧光色素，是嗜酸性染色剂，通常被于检测自噬体形成的特异性标记染色剂,其检测激发滤光片波长355nm ,阻断滤光片波长512nm。细胞分化细胞分化是指同一来源的细胞逐渐产生出形态结构、功能特征各不相同的细胞类群的过程，其结果是在空间上细胞产生差异，在时间上同一细胞与其从前的状态有所不同。Leagene MDC染色液适用于培养细胞的自噬染色，可与EB合用双染。

小鼠成骨细胞和破骨细胞共培养模型的建立

细胞之间的相互调控作用奠定基础.方法利用24 h内新生小鼠颅骨和4~8周龄成年小鼠四肢长分别分离、培养成骨细胞和破骨细胞，采用间接接触的培养模式将接种了骨sui单核细胞的玻片或骨片置入提前24 h接种了成骨细胞的培养皿中进行共培养.共培养-定时间后进行破 骨细胞抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP染色鉴定和骨吸收功能检测，并进一 步采用RT- PCR对破骨细胞标志酶基因基质金属蛋白酶.9(MMP-9)、TRAP 和组织蛋白酶K (Cathepsin K )的表达进行检测结果共培养5天后可观TRAP(+)多核细胞形成13天TRAP(+ )多核细胞数目达到高峰;骨吸收陷窝在共培养7天后开始出现,随着培养时间的延长,陷窝面积呈增加趋势;破骨细胞标志基因TRAP在共培养3天时开始表达，而MMP-9和Cathepsin K则在共培养5天后表达结论共培养体系中成骨细胞对破骨细胞调控作用显著诱导的破骨细胞具有噬骨能力，该共培养模型可用于成骨细胞和破骨细胞之间的相互调控作用研究.

目的

学习和掌握外源基因导入真核细胞的主要方法——脂质体介导的转染。了解外源基因进入的一般性方法，观测外源蛋白的表达（绿色荧光蛋白），为染色准备实验材料。

实验原理

上图所示是脂质体介导转染的示意图，它显示了外源质粒进入细胞的一般过程。

外源基因进入细胞主要有四种方法：法、磷酸钙法和脂质体介导法和病毒介导法。法是在细胞上短时间暂时性的穿孔让外源质粒进入；磷酸钙法和脂质体法是利用不同的载体物质携带质粒通过直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因进入细胞；透射电镜观察自噬小体方法利用光学显微镜，借助相应的染色方法，可以观察细胞凋亡时会出现的一系列形态特征。病毒法是利用包装了外源基因的病毒细胞的方法使得其进入细胞。但是由于法和磷酸钙法的实验条件控制较严、难度较大；病毒法的前期准备较复杂、而且可能对于细胞有较大影响；所以现在对于很多普通细胞系，一般的瞬时转染方法多采用脂质体法。

利用脂质体转染法重要的就是防止其毒性，因此脂质体与质粒的比例，细胞密度以及转染的时间长短和培养基中的含量都是影响转染效率的重要问题，通过实验摸索的合适转染条件对于效率的提高有巨大的作用。

关于细胞培养的常见问题

Q：培养液到底要不要加双抗（青&链）？

A：双抗不是细胞生长必需的。我们培养细胞时不常规使用，因为连续使用会促进耐药性细胞株的产生，导致轻度污染持续存在。一旦将从培养液中去除，这种轻度污染终将发展成为大规模污染。具体情况，可根据自己实验室的环境，自行决定是否使用双抗。

Q：细胞培养，能更换成其它种类的培养基吗？

A：我们强烈建议好使用细胞提供机构或细胞库推荐的生长培养液。有些细胞可能会适应在不同培养基中生长，在做好保种的条件下，可以分出部分细胞做测试。