细胞实验外包费用泌尿生殖系统模型「英瀚斯」

细胞实验介绍——细胞运动能力检测：

细胞划痕实验是体外模拟细胞迁移能力和修复能力快捷的检测方法。在长满的细胞培养板或者培养皿中，沿着中线使用移液器头或者其他硬物划1-3条平行的直线，去除中线的细胞，细胞在0h、12h、24h后，观察细胞往中线迁移情况，判断细胞迁移能力。

一般流程：细胞接种培养-划痕-不同时间点拍照

细胞迁移和侵袭实验是体外模拟细胞迁移和侵袭能力的检测方法。使用不同孔径的聚碳酸酯膜transwell小室放入培养板中，将细胞接种于小室中，利用培养液成分的差异诱导细胞运动，检测细胞的迁移和侵袭能力的差异。

一般流程：transwell小室准备-细胞接种-细胞培养-transwell小室染色-显微镜拍照

结果示例：

                                       图 A 细胞划痕实验图；B，C 细胞迁移和侵袭实验图

 细胞ELISPOT检测    

     1．培养板的预处理：在24孔培养板内加0.5ml 0.2%戊er醛，37℃，4h，弃掉板中的处理液，用PBS洗涤3次，每次3min；

     2．抗原包被：将适量抗原溶于包被缓冲液中，每孔加入0.5ml，4℃过夜，PBS-T洗涤3次，每次3min；

     3．制备细胞悬液：将待测已致敏小鼠处死，取出pi脏，置于加有Hanks液的平皿内，用钝头直角9号zhu射器针头破少许脾被膜后，赶出细胞，用毛细吸管轻轻吹散细胞团后，将悬液通过250目尼龙网，取滤液，1000r/min离心5min，Hanks液洗涤3次，计数细胞后，用1640液重新悬浮细胞，配成所需浓度；0磷酸钠-柠檬酸缓冲液配制）边加边搅，溶液呈白色，加入14μl3%H202。

     4．往各孔中加入0.5ml含不同浓度（104-106/ml）的细胞悬液，置37℃，5％CO2条件下孵育2-4h，弃掉培养液，PBS-T洗涤3次，每次3min；

     5．往各孔中加入0.5ml生物素化抗ti（Bio-Ab）（2μg/ml），37℃孵育1h或4℃过夜，弃掉液体，PBS-T洗涤3次，每次3min；

     6．加入辣根过氧化物酶结合的亲合素（Avi-HRP）（2μg/ml），37℃孵育30min，弃掉液体，PBS-T洗涤3次，每次3min；

     7．配制明胶-底物液：在37℃水浴中，将2.5mlTMB溶液（4mg/ml  jia醇溶液）滴加入7.5ml10%明胶溶液（用pH5.0磷酸钠-柠檬酸缓冲液配制）边加边搅，溶液呈白色，加入14μl 3% H202；

     8．显色与计数：将培养板底冰浴，每孔加入0.6ml明胶-底物液，约3min，混合液凝固，将培养板取出，置室温5min，将板倒置，用肉眼和低倍放大镜计数所显示出的颜色的斑点。

杂交瘤细胞基因测序

杂交瘤细胞有丢失高特异性高活性的风险，或者细胞状态不好乃至。而经过杂交瘤测序，可以获得相应的序列，可以以重组蛋白的方式来稳定获得；5ml生物素化抗ti（Bio-Ab）（2μg/ml），37℃孵育1h或4℃过夜，弃掉液体，PBS-T洗涤3次，每次3min。从而使得研发或生产者不必以杂交瘤细胞为载体保留该，而可以以碱基序列的形式进行保存和传播交流、鉴定。同时还可以使用获得的测序结果进行等知识产权方面的申请审批。有时为了进一步大规模生产或进行人源化等生物工程操作/修饰，有必要了解杂交瘤所表达的对应的基因序列以进一步进行生物工程操作与生产。

相较于直接对进行基于蛋白质分析的测序相比，得益于基因测序技术的发展，杂交瘤测序可以提供的结果，防止蛋白测序中如亮氨酸/异亮氨酸较难区分等潜在风险。

1、操作步骤 [方法一]：

(1) 细胞培养：取 6 孔培养板 (或用 35 mm 培养皿)，向每孔中加入 2 mL 含 1～2×105 个细胞培养液，37℃ CO2 培养至 40%～60% 汇合时 (汇合过分，转染后不利筛选细胞)。

(2) 转染液制备：在聚苯乙稀管中制备以下两液 (为转染每一个孔细胞所用的量)A 液：用不含培养基稀释 1-10 μg DNA，终量 100μL，B 液：用不含培养基稀释 2-50 μgLR，终量 100μL，轻轻混合 A、B 液，室温中置 10-15 分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染 (如出现沉淀可能因 LR 或 DNA 浓度过高所致，应酌情减量)。共培养-定时间后进行破骨细胞抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistantacidphosphatase,TRAP染色鉴定和骨吸收功能检测，并进一步采用RT-PCR对破骨细胞标志酶基因基质金属蛋白酶。

(3) 转染准备：用 2 mL 不含培养液漂洗两次，再加入 1 mL 不含培养液。

(4) 转染：把 A/B 复合物缓缓加入培养液中，摇匀，37℃ 温箱置 6～24 小时，吸除无转染液，换入正常培养液继续培养。

(5) 其余处理如观察、筛选、检测等与其它转染法相同。

注意：转染时切勿加，对转染效率有很大影响。