fish检测动物实验模型「多图」

聚合酶链式反应(PCR)

操作步骤

1.在冰浴中,按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。

1QPCR buffer

5 μl

dNTP mix( 2mM )

4 μl

引物1(10pM)

μl 2

引物2 ( 10pM)

2μl

Taq酶(2U/ul)

1 μl

DNA模板( 50ng-1μg/μl )

加ddH2O至

μl 50

视PCR仪有无热盖,不加或添加石蜡油。

2.调整好反应程序。将上述混合液稍加离心,立即置PCR仪上执行扩增。-般:在93°C

预变性3-5min ,进入循环扩增阶段: 93°C 40s→58°C 30s→72°C 60s ,循环30-35

次，后在72°C保温7min。

3.结束反应, PCR产物放置于4°C待电泳检测或-20°C长期保存。

4. PCR的电泳检测:如在反应管中加有石蜡油,需用100ul进行抽提反应混合液,以

除去石蜡油;否则,直接取5- 10μl电泳检测。

RNA提取

1.弃去培养液，用PBS清洗两次1-2。

2.弃去PBS，用1000u1吸干净残余PBS。

3.加1ml TRIZOL研磨B 41。

4. 1.5mIEP管标号与每孔相对应备用。

5.研磨好的溶液转移至对应的 EP管中国。

6.往每个EP管中加入250ul，剧烈震荡30s， 冰上静置12min[问l。

7. 所有样品4C离心，转速: 13500转1分钟，时间: 15min.

8. 再次标记一批同样编号EP管。

9.离心后吸上清液400u1移入相应编号的EP管中，再加入400ul异充

分混匀。4C冰箱35min。

10. 4C离心，转速: 13500转1分钟，时间: 10min.

11.弃去.上清液，加1m175%乙醇，轻摇7]。

12. 4C离心，10600转/分钟，时间: 5min.

13. 弃上清液滤纸吸干。

14. 加DEPC水10ul溶解，-80C保存。进行逆转录前测浓度。

组织RNA提取

1、剪米粒大小组织块放入EP管中标号。

2、EP管中加300ul trizol浸泡30分钟或更久。

3、用研磨棒研磨，以肉眼很难看到组织为宜。

4、加700u1 trizol静 置5分钟。

腺相关病毒包装原理

腺相关病毒( adeno-associated virus, AAV)是一类细小病毒, 基铟组为单链DNA ,对分裂细胞和非分裂细胞均具有gan染能力。通常需要腺病毒或疱zhen病毒帮助其在体内fu制扩增。重组腺相关病毒( recombinant AAV, rAAV )是利用AAV2型基因组与不同xue清型的衣壳蛋白基因组结合产生的混合体病毒载体,可将目的基因的CDS区序列或者RNAi干扰序列插入rAAV表达质粒中,包装病毒后gan染细胞完成对目的基因的操作。二、大肠菌群检验方法:由于大肠菌群指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，即:需氧及兼性厌氧、在37°C能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞。腺相关病毒具有gan染温和,免yi原性小,长效稳定表达的特点,主要应用于动物体内注射。源井生物提供的腺相关病毒颗粒经过超su离心纯化,并通过qPCR对病毒基因拷贝进行滴定。腺相关病毒的滴度在10^12~10^13GC/ml ,可以满足各类整体实验的使用要求。

9.如何计算引物的Tm值？

答：引物设计软件都可以给出Tm，与引物长度、碱基组成、引物使用缓冲的离子强度有关。

长度为25mer以下的引物，Tm计算公式为：

Tm =            4℃   (G + C)+ 2℃   (A + T)

对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：

Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) - 600/size

公式中，Size = 引物长度。

Tm的定义：Tm = Temperature at which 50% of a given oligonucleotide is hybridized to its complementary strand. In the absence of destabilizing agents, like formamide or urea, Tm will depend on 3 major parameters: The sequence: a GC-rich sequence has a higher melting temperature. The strand concentration: high oligonucleotide concentrati favor hybrid formation, which results in a higher melting temperature. The salt concentration: high ionic strength results in a higher Tm as cati stabilize the DNA duplexes.