绍兴PCR***「英瀚斯」

蛋白提取

大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液, 少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丁醇等有ji溶剂中，因些，可 采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。

(一)水溶液提取法

稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质常用的溶剂,通常用量是原材料体积的1-5倍,提取时需要均匀的搅拌,以利于蛋白质的溶解。外显子测序外显子组测序（exome-seq）是对定向富集的基因组DNA进行高通量测序，它能够以相对低的费用对人类外显子组进行拷问。提取的温度要视有效成份性质而定。一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶 解，缩短提取时间。但另一方面. ,温度升高会使蛋白质变性失活,因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温( 5度以下)操作。为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白 水解酶抑zhi剂(如二yi丙基氟磷酸,碘yi酸等)。

3.引物的OD数如何定量？

答：引物合成引物OD数是这样测定的：用紫外分光光度计，波长260nm，石英比色杯，光程为1厘米，测定溶液的光密度。染色质免l疫共沉淀技术(ChIP)基于体内分析而发展的染色质免l疫沉淀分析Chromatinimmunoprecipitationassaykit,ChIP)技术可以真实、完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白。测定时溶液的光密度好稀释到0.2-1.0之间。DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后，用1ml水稀释测OD值。需要根据稀释倍数换算出母液的OD值。

4.需要什么级别的引物？

答：引物常用的纯化方式脱盐、BioRP / OPC纯化、PAGE纯化、HPLC纯化。根据实验需要，确定订购引物的纯度级别。

7.如何检测引物的纯度？

答：实验室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的16%的聚酰胺凝胶进行电泳。腺相关病毒包装原理腺相关病毒(adeno-associatedvirus,AAV)是一类细小病毒,基铟组为单链DNA,对分裂细胞和非分裂细胞均具有gan染能力。取0.2-0.5OD的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性(95℃,2mins)。加入尿素的目的一是变性，二是增加样品比重，容易加样。600V电压进行电泳，一定时间后(约2-3小时)，剥胶，用荧光TLC板在紫外灯下检测带型，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的。如果条件许可，也可以用EB 染色或银染方式染色。

而有的厂家提供Maldi-TOF质谱QC质量控制，从而保障了合成的准确率：

Bioneer使用多重Maldi-TOF质谱仪进行全自动装载及监测。同一细胞在不同的生长时期及生长环境下，其基因表达情况是不相同的。 每份样品的质谱分析数据将自动插入到寡核苷酸的信息单中。Bioneer是世界上仅有的几个对生产的每份核苷酸 (单个寡核苷酸和高通量和成) 都用MALDI-TOF质谱仪检测进行核苷酸QC检测的厂商，而且免费提供质谱数据。

8.如何计算引物的浓度？

答：引物保存在高浓度的状况下比较稳定。富衡生物为用户提供高通量的lncRNA芯片进行lncRNA表达谱分析，该芯片基于Agilent的SurePrint技术生产，实验***。引物一般配制成10-50pmol/ul。 一般情况下，建议将引物的浓度配制成50pmol/ul，加水的体积（微升）按下列方式计算：V (微升)= OD数*（乘）33 *（乘）*（乘）20000 / (除) 引物的分子量。引物的分子量可以从合成报告单上获得。如果需要配制成其他浓度，按上述公式换算。

注意：1 OD260= 33 ug/ml.