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甲l基化特异性的PCR

Herman 等（ 1996 ）在使用重亚硫酸盐处理的基础上新建的一种方法。该方法敏感性高，主要用于作定性研究。4、聚合完成后，SYBRGreen染料与双链产物结合，定量PCR系统检测到荧光的净增量加大。用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生jia基化的胞嘧定被转化为尿嘧ding，而jia基化的胞嘧定不变；随后设计针对jia基化和非jia基化序列的引物进行PCR。通过电泳检测MSP扩增产物，如果用针对处理后jia基化DNA链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在jia基化；反之，说明被检测的位点不存在jia基化。

特点：适用范围广，能够检测特异位点是否发生jia基化。

亚硫酸氢盐测序法（Bisulfite sequencing PCR，BSP）

亚硫酸氢盐修饰后测序法（ BSP ） Frommer 等（ 1992 ）提出的研究 DNA jia基化方法，此方法可靠性及jing确度高，能明确目的片段中每一个 CpG 位点的jia基化状态。用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生jia基化的胞嘧ding被转化为尿嘧ding，而jia基化的胞嘧ding不变。随后设计BSP引物进行PCR，在扩增过程中尿嘧定全部转化为胸腺嘧定，zui后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生jia基化，称为BSP-直接测序法。蛋白质互作验证服务在后基因组时代，基因的表达产物蛋白质作为生物功能直接的执行者和体现者，在生物集体的生理及病理中扮演着重要的角色。将PCR产物克long至载体后进行测序，可以提高测序成功率，这种方法称为BSP-ke隆测序法。

特点：jing确度高，能够准确检测出jia基化的程度百分比。

DNA测序检测

1. PCR测序反应

(1)取0.2ml的PCR管，用记号笔编号，将管插在颗粒冰中，按下表加试剂:

所加试剂测定模板管标准对照管

BigDye Mix

1μl

待测的质粒DNA

1μ 1

pGEM-3Zf (+)双链DNA

-1μ1

待测DNA的正向引物

M13(-21)引物- 1μ 1

灭菌去离子水

2μ 1

总反应体积5μ 1,不加轻矿物油或石蜡油，盖紧PCR管，用手指弹管混匀，稍离心。

(2)将PCR管置于9600或2400型PCR仪.上进行扩增。98C变性2min后进行PCR循环，

PCR循环参数为96C 10s， 50C 5s， 60°C4min， 25 个循环，扩增结束后设置4C保温。

2.乙醇法纯化PCR产物

(1) 将混合物离心，将扩增产物转移到1.5ml EP管中。

(2)加入25μ 1/乙醇混合液，充分振荡，置冰上10min以沉淀DNA。12 000r/min于

4C离心30 min,小心弃上清。

(3)加70%(V/V)的乙醇50μ 1 洗涤沉淀2次。12 000r/min 于4C离心5min,小心弃上清和

管壁的液珠，真空干燥沉淀10~ 15min。

3.电泳前测序PCR产物的处理。

(1)加入12μ 1的TSR于离心管中，剧烈振荡，让其充分溶解DNA沉淀，稍离心。

(2)将溶液转移至盖体分离的0.2ml PCR管中，稍离心。

(3)在PCR仪上进行热变性(95C 2min),冰中骤冷，待_上机。

4..上机操作按仪器操作说明书安装毛细管，进行毛细管位置的校正，人工手动灌胶和建立

运行的测序顺序文件。

5.仪器将自动进行序列分析，并可根据用户要求进行序列比较。如测序序列已知，可通过

序列比较以星号标出差异碱基处，提高工作效率。

6.测序完毕按仪器操作规程进行仪器清洗与保养。

注意事项

1. 为了避免蛋白质变性，不要对样品剧烈搅动和反复冻融。

2. 缓冲溶液成分尽量模拟细胞内环。。

3. 为了避免蛋白质的氧化，将 0.1～1 mmol/LDTT（二硫苏糖醇）(或 β-巯）加入到缓冲溶液中。

4. 为了避免重金属对目标蛋白的破坏，将 1～10 mmol/LEDTA 金属螯合剂加入。

5. 为了避免微生物生长，使用灭菌溶液。在纯化任何一种蛋白质的时候，均必须时刻对它的稳定性注意维护，使它的活性得到保护，需要牢记如下一些通用的注意事项。

6. 尽可能置于冰上或者在冷库内进行操作。

7. 蛋白浓度不要太稀。

8. 除非是进行聚焦层。否则 pH 需要合适，防止所使用的缓冲溶液 pH 与 pI 相同，使蛋白质的沉淀得以避免。

9. 使用蛋白酶，避免蛋白酶对目标蛋白的降解；在纯化细胞中的蛋白质时，将 DNA 酶加入来使得 DNA 降解，避免 DNA 对蛋白的污染。