实时定量pcr分子生物学检测「英瀚斯」

动物组织细胞基因组DNA提取

操作步骤

1. 取新鲜或冰冻动物组织块0.1g（0.5cm3），尽量剪碎。置于玻璃匀浆器中，加入1ml的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块，转入1.5ml 离心管中，加入蛋白酶K

（500ug/ml）20μl，混匀。在65℃恒温水浴锅中水浴30min，也可转入37℃水浴12～24h，间歇振荡离心管数次。于台式离心机以12000 rpm离心5min，取上清液入另

一离心管中。

2.加2倍体积异，倒转混匀后，可以看见丝状物，用100ul 吸头挑出，凉干，用200ul TE 重新溶解。（可进行PCR反应等，需要进一步纯化的按下列步骤进行）

3.加等量的酚??振荡混匀，离心12000 rpm，5min。

4.取上层溶液至另一管，加入等体积的?，振荡混匀，离心12000 rpm，5min。

5. 取上层溶液至另一管，加入1/2体积的7.5mol/L氨加入2倍体积的无水乙醇，混匀后室温沉淀2min ，离心12000 rpm ,10min。

6.小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉。

7.用1ml 70%乙醇洗涤沉淀物1次，离心12000 rpm ， 5min。

8.小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉，室温干燥。

9.加200ul TE重新溶解沉淀物，然后置于4℃或?C20℃保存备用。

10.吸取适量样品于GeneQuant上检测浓度和纯度。

DNA测序检测

1. PCR测序反应

(1)取0.2ml的PCR管，用记号笔编号，将管插在颗粒冰中，按下表加试剂:

所加试剂测定模板管标准对照管

BigDye Mix

1μl

待测的质粒DNA

1μ 1

pGEM-3Zf (+)双链DNA

-1μ1

待测DNA的正向引物

M13(-21)引物- 1μ 1

灭菌去离子水

2μ 1

总反应体积5μ 1,不加轻矿物油或石蜡油，盖紧PCR管，用手指弹管混匀，稍离心。

(2)将PCR管置于9600或2400型PCR仪.上进行扩增。98C变性2min后进行PCR循环，

PCR循环参数为96C 10s， 50C 5s， 60°C4min， 25 个循环，扩增结束后设置4C保温。

2.乙醇法纯化PCR产物

(1) 将混合物离心，将扩增产物转移到1.5ml EP管中。

(2)加入25μ 1/乙醇混合液，充分振荡，置冰上10min以沉淀DNA。12 000r/min于

4C离心30 min,小心弃上清。

(3)加70%(V/V)的乙醇50μ 1 洗涤沉淀2次。12 000r/min 于4C离心5min,小心弃上清和

管壁的液珠，真空干燥沉淀10~ 15min。

3.电泳前测序PCR产物的处理。

(1)加入12μ 1的TSR于离心管中，剧烈振荡，让其充分溶解DNA沉淀，稍离心。

(2)将溶液转移至盖体分离的0.2ml PCR管中，稍离心。

(3)在PCR仪上进行热变性(95C 2min),冰中骤冷，待_上机。

4..上机操作按仪器操作说明书安装毛细管，进行毛细管位置的校正，人工手动灌胶和建立

运行的测序顺序文件。

5.仪器将自动进行序列分析，并可根据用户要求进行序列比较。如测序序列已知，可通过

序列比较以星号标出差异碱基处，提高工作效率。

6.测序完毕按仪器操作规程进行仪器清洗与保养。

miRNA测序

microRNA(miRNA)是一种大小约21—23个碱基的单链小分子RNA，是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成，不同于siRNA（双链）但是和siRNA密切相关。microRNA通过和靶基因mRNA碱基配对引导沉默复合体（RISC）降解mRNA或抑制mRNA的翻译，从而在转录后水平调控蛋白表达（新发现miRNA也能在转录水平调控基因表达）。miRNA在物种进化中相当保守，在动物、植物和真菌等中发现的miRNA表达均有严格的组织特异性和时序性。miRNA在细胞生长和发育过程中起多种作用，包括调控发育、分化、凋亡和增殖等。miRNA在细胞生长和发育过程中起多种作用，包括调控发育、分化、凋亡和增殖等。

目前研究miRNA的方法主要是realtime-PCR、生物芯片技术以及第二代测序技术。基于第二代测序技术的miRNA测序，可以一次获得数百万条miRNA序列，能够快速鉴定出不同组织、不同发育阶段、不同疾病状态下已知和未知的miRNA及其表达差异，为研究miRNA对细胞进程的作用及其生物学影响提供了有力工具。由于腺病毒的这些特点使其广泛地应用于体外基因转导、体内接种yi苗、和基因zhi疗等各个领域。

转录组重测序      

      转录组测序的研究对象为特定细胞在某一功能状态下所能转录出来的所有mRNA的总和。转录组研究是基因功能及基因结构等研究的基础，通过新一代高通量测序，能够快速的获得某一物种特定组织或在某一状态下的几乎所有转录本序列信息，已广泛应用于临床诊断、基础研究和研发等领域。(一)水溶液提取法稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质常用的溶剂,通常用量是原材料体积的1-5倍,提取时需要均匀的搅拌,以利于蛋白质的溶解。

     转录组Resequencing针对的是有参考基因组的物种。用新一代高通量测序技术对某物种的特定组织或细胞进行转录组测序，与参考基因组比较，可以得到基因表达差异、可变剪接、融合基因等遗传调控信息。