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发布时间:2020-12-07 16:14:00 作者:英瀚斯
全转录组测序
全转录组是指特定组织或细胞在特定状态下所有转录产物的总和,包括mRNA和各种noncoding RNA。我们知道生物体本身的转录过程是一个动态变化且十分复杂的分子作用网络,如果只是对某个单一RNA分子的研究,有时并不能准确的发现分子作用机制。而竞争性内源RNA(ceRNA)理论阐述了一种全新的转录调控模式:ceRNA(包括lncRNA、circRNA、mRNA、假基因等)分子能够通过miRNA应答元件(microRNA Respe Element, MRE)竞争性地结合相同的miRNA来调节彼此的表达水平。举个例子:miRNA会导致基因沉默现象发生,而如果lncRNA竞争性结合了miRNA,从而影响了miRNA基因沉默功能实现。
ceRNA是目前转录调控领域的热点内容之一,通过全转录组研究能够系统性的阐述ceRNA的分子作用机制。目前对全转录组简便的方法就是构建2个测序文库分别进行测序。标准的生物信息学分析能够得到mRNA、lncRNA、circRNA、miRNA各自的研究内容,靶向调控网络、ceRNA网络、共表达网络分析可以将这几种RNA联合起来分析,从而发现新的调控网络模型。去除rRNA的链特异性文库,含有的RNA信息含量十分丰富,通过测序和生物信息学分析能够得到mRNA、lncRNA、circRNA的鉴定及注释信息。不过该文库构建时会进行片段化选择从而滤掉了small RNA的信息,所以需要另外再构建一个small RNA文库,进行测序分析后可以得到miRNA和其他small RNA的鉴定及注释信息。全转录组测序方案路线图如下所示:
腺相关病毒包装原理
腺相关病毒( adeno-associated virus, AAV)是一类细小病毒, 基铟组为单链DNA ,对分裂细胞和非分裂细胞均具有gan染能力。通常需要腺病毒或疱zhen病毒帮助其在体内fu制扩增。重组腺相关病毒( recombinant AAV, rAAV )是利用AAV2型基因组与不同xue清型的衣壳蛋白基因组结合产生的混合体病毒载体,可将目的基因的CDS区序列或者RNAi干扰序列插入rAAV表达质粒中,包装病毒后gan染细胞完成对目的基因的操作。腺相关病毒具有gan染温和,免yi原性小,长效稳定表达的特点,主要应用于动物体内注射。源井生物提供的腺相关病毒颗粒经过超su离心纯化,并通过qPCR对病毒基因拷贝进行滴定。腺相关病毒的滴度在10^12~10^13GC/ml ,可以满足各类整体实验的使用要求。
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