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聚合酶链式反应(PCR)

操作步骤

1.在冰浴中,按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。

1QPCR buffer

5 μl

dNTP mix( 2mM )

4 μl

引物1(10pM)

μl 2

引物2 ( 10pM)

2μl

Taq酶(2U/ul)

1 μl

DNA模板( 50ng-1μg/μl )

加ddH2O至

μl 50

视PCR仪有无热盖,不加或添加石蜡油。

2.调整好反应程序。将上述混合液稍加离心,立即置PCR仪上执行扩增。-般:在93°C

预变性3-5min ,进入循环扩增阶段: 93°C 40s→58°C 30s→72°C 60s ,循环30-35

次，后在72°C保温7min。

3.结束反应, PCR产物放置于4°C待电泳检测或-20°C长期保存。

4. PCR的电泳检测:如在反应管中加有石蜡油,需用100ul进行抽提反应混合液,以

除去石蜡油;否则,直接取5- 10μl电泳检测。

RNA提取

1.弃去培养液，用PBS清洗两次1-2。

2.弃去PBS，用1000u1吸干净残余PBS。

3.加1ml TRIZOL研磨B 41。

4. 1.5mIEP管标号与每孔相对应备用。

5.研磨好的溶液转移至对应的 EP管中国。

6.往每个EP管中加入250ul，剧烈震荡30s， 冰上静置12min[问l。

7. 所有样品4C离心，转速: 13500转1分钟，时间: 15min.

8. 再次标记一批同样编号EP管。

9.离心后吸上清液400u1移入相应编号的EP管中，再加入400ul异充

分混匀。4C冰箱35min。

10. 4C离心，转速: 13500转1分钟，时间: 10min.

11.弃去.上清液，加1m175%乙醇，轻摇7]。

12. 4C离心，10600转/分钟，时间: 5min.

13. 弃上清液滤纸吸干。

14. 加DEPC水10ul溶解，-80C保存。进行逆转录前测浓度。

组织RNA提取

1、剪米粒大小组织块放入EP管中标号。

2、EP管中加300ul trizol浸泡30分钟或更久。

3、用研磨棒研磨，以肉眼很难看到组织为宜。

4、加700u1 trizol静 置5分钟。

3.引物的OD数如何定量？

答：引物合成引物OD数是这样测定的：用紫外分光光度计，波长260nm，石英比色杯，光程为1厘米，测定溶液的光密度。测定时溶液的光密度好稀释到0.2-1.0之间。DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后，用1ml水稀释测OD值。在竞争的特异和非特异片段的存在下，依据复合物的特点和强度来确定特异结合。需要根据稀释倍数换算出母液的OD值。

4.需要什么级别的引物？

答：引物常用的纯化方式脱盐、BioRP / OPC纯化、PAGE纯化、HPLC纯化。根据实验需要，确定订购引物的纯度级别。