绍兴流式细胞检测结果分析信赖推荐「英瀚斯」

细胞实验介绍——慢病毒建立稳转细胞系

慢病毒包装：公司使用3质粒慢病毒包装系统，慢病毒系统使用pLKO.1-***P、psPAX2、pMD2.G，过表达慢病毒系统使用pLVX-AcGFP、psPAX2、pMD2.G三质粒系统，将质粒混匀后使用磷酸钙转染方法转染至HEK293T细胞中，培养48h后，收集上清。2)阳性CD117(c-kit)阴性特点用流式细胞仪将精原gan细胞分选出来,并在体外进行培养尝试。使用genecopo公司慢病毒颗粒纯化试剂盒将慢病毒纯化。纯化后留取部分检测病毒滴度，其余病毒冻存于-80℃冰箱中。

滴度检测：将病毒颗粒使用梯度稀释，分别293T细胞，72h后，在荧光显微镜下观察细胞荧光表达情况。根据细胞荧光量计算病毒滴度。

细胞：在病毒前一天对细胞进行计数，接种约10000个细胞于12孔板中，培养过夜后使用无培养基稀释病毒，加入12孔板中对细胞进行，病毒数量根据推荐细胞的MOI加入（若无推荐MOI，需做病毒梯度：1,5,10,50,100 5个梯度对细胞），6h后去除含病毒溶液，加入完全培养基细胞培养，培养48h后，在荧光显微镜下观察细胞荧光强度。利用这一原理，可以将AnnexinV标记荧光来识别早期的细胞凋亡。同时加入puromycin对细胞筛选，筛选约2周时间。细胞筛选好后，使用定量PCR和Western blot检测目的基因的稳定表达情况。

实验流程：慢病毒质粒构建-HEK293T细胞培养-质粒转染293T细胞-病毒收集-病毒纯化-病毒滴度检测-细胞-稳转细胞筛选-稳转细胞鉴定

结果示例：

                                               图 A 病毒滴度检测；B 目的细胞病毒效果图

MTT检测

MTT 是一种检测细胞存活和生长的方法。小鼠成骨细胞和破骨细胞共培养模型的建立细胞之间的相互调控作用奠定基础。其检测原理为活xi胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性 MTT 还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二jia基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免yi检测仪在 570nm 波长处测定其光吸收值，可间接反映活xi胞数量。

细胞冻存有哪些注意事项？

细胞培养的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费，而且细胞一旦离开开始原代培养，它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。用200μ的移液***反复、快速地吹打平皿中的液体，转移至15ml离心管中，于4C1500rpm离心5分钟，倒掉上清，以10ml胰酶重悬沉淀，放在37C水浴中消化30分钟，且每隔五分钟轻轻晃动，使之充分消化。因此及时进行细胞冻存十分必要。细胞冷冻储存在-70℃冰箱中可以保存一年之久;细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是的。

细胞冻存的步骤：

配制含 10%DMSO 或甘油、10~20% 小牛的冻存培养液;

取对数生长期的细胞，去除旧培养液，用 PBS 清洗。

去除 PBS，加入适量胰蛋白酶 (覆盖培养皿表面) 把单层生长的细胞消化下来;

离心 1000rpm，5min;

去除胰蛋白酶，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的终密度为 5×106/ml~1×107/ml;

将细胞分装入冻存管中，每管 1~1.5 ml;

在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者;

冻存:标准的冻存程序为降温速率-1~-2℃/ min;当温度达-25℃以下时，可增至-5℃~-10℃/min;到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。透射电镜观察自噬小体方法利用光学显微镜，借助相应的染色方法，可以观察细胞凋亡时会出现的一系列形态特征。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱 2h ，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。