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细胞毒性实验询价咨询 南京英瀚斯

发布时间:2022-07-13 04:05:00        作者:英瀚斯







软琼脂培养克l隆形成试验基本步骤:

(1)取对数生长期细胞,用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打,使之成为单细胞,作活l细胞计数,用含20%胎牛血l清的DMEM培养液调整细胞密度至1x106细胞/L。然后根据实验要求作梯度倍数稀释。

(2)用蒸馏水分别制备出1.2%和0.7%两个浓度的低溶点琼脂糖液,高压灭菌后,维持在40日中不会凝固。

(3)按1:1比例使1.2%的琼脂糖和2xDMEM培养基(含有2x和20%的小牛血l清)混合后,取3mL混合液注入直径6cm平皿中(10cm平皿加7~ 10mL),冷却凝固,可作底层琼脂置CO2温箱中备用。

(4)按1:1比例让0.7%的琼脂糖和2xDMEM培养基在无菌试管中相混以后,再向管中加入0.2mL的细胞悬液,充分混匀,注入铺有1.2%琼脂糖底层平皿中,逐形成双琼脂层。待上层琼脂凝固后,置入37回5%CO2温箱中培养10~14天。

(5)把平皿放置在倒置显微镜下,观察细胞数。计算形成率。软琼脂培养法常用检测肿l瘤细胞和转化细胞系。试验中琼脂与细胞相混时,琼脂温度不宜超过40日。接种细胞的密度每平方厘米不超过35个,一般6cm的平皿接种1000个细胞。管底的细胞团不要打散,沿管壁倒入适量(一般为材料体积的5-10倍)的2。正常细胞在悬浮状态下不能增殖,不适用于软琼脂克l隆形成试验。

软琼脂集落形成率实验(软琼脂克l隆)

将1.2%低熔点琼脂糖与2x细胞培养基以1:1的体积比混合制备0.6%的底层琼脂,6孔板中每个孔1.4ml温室凝固,取对数期细胞,胰酶消化后吹散成单个细胞悬液,计数,并调细胞浓度为10000个/ml,将0.6%低熔点琼脂糖与2x细胞培养基以1:1的体积比混合,制备0.3%的上层琼脂,每孔加1ml 上层琼脂和100ul单细胞悬液(约1000ell/wel), 混匀,室温凝固。置于37目,5%CO2的细胞培养箱中培养2-3周,计数含50个细胞以上得克l隆,计算细胞集落形成率,Spotll 采集图像。0磷酸钠-柠檬酸缓冲液配制)边加边搅,溶液呈白色,加入14μl3%H202。








细胞培养中常见的污染及解决方法

原生动物污染

原生动物污染后,细胞培养基变得轻微浑浊。在显微镜下,大量的小点来回移动。虽然此时细胞仍能生长,但繁殖速度减慢,细胞生长状态不好,边缘不清,变得不透明。原生动物与细胞形成共生关系。同时,原生动物与细胞竞争营养。原代细胞培养:(1)shen脏原位灌洗:SD大鼠用25%乌拉坦腹整注射麻zui后仰卧固定。这种共生现象非常普遍,但以细胞为主,因为原生动物的数量相对较少,因而对细胞的正常生长没有影响,只有当它们达到一定数量时,才终爆发成为循环。

解决方法:原生动物污染的原因有很多,如液体消毒问题、操作问题、环境问题等,如果细胞足够,果断丢弃被污染的细胞和复苏细胞。如果要保留,需要购买使用相关的灭菌试剂。





二、脂质体转染操作步骤

1、操作步骤 [方法一]:

(1) 细胞培养:取 6 孔培养板 (或用 35 mm 培养皿),向每孔中加入 2 mL 含 1~2×105 个细胞培养液,37℃ CO2 培养至 40%~60% 汇合时 (汇合过分,转染后不利筛选细胞)。

(2) 转染液制备:在聚苯乙稀管中制备以下两液 (为转染每一个孔细胞所用的量)A 液:用不含培养基稀释 1-10 μg DNA,终量 100μL,B 液:用不含培养基稀释 2-50 μgLR,终量 100μL,轻轻混合 A、B 液,室温中置 10-15 分钟,稍后会出现微浊现象,但并不妨碍转染 (如出现沉淀可能因 LR 或 DNA 浓度过高所致,应酌情减量)。电镜下凋亡细胞表现为染色质凝集、核浓缩、核裂解、胞浆收缩和胞膜具有发泡现象及凋亡小体出现等。

(3) 转染准备:用 2 mL 不含培养液漂洗两次,再加入 1 mL 不含培养液。

(4) 转染:把 A/B 复合物缓缓加入培养液中,摇匀,37℃ 温箱置 6~24 小时,吸除无转染液,换入正常培养液继续培养。

(5) 其余处理如观察、筛选、检测等与其它转染法相同。

注意:转染时切勿加,对转染效率有很大影响。



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