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山西细胞融合实验报告承诺守信「在线咨询」

发布时间:2022-07-09 18:29:00        作者:英瀚斯







细胞实验介绍——慢病毒建立稳转细胞系

慢病毒包装:公司使用3质粒慢病毒包装系统,慢病毒系统使用pLKO.1-***P、psPAX2、pMD2.G,过表达慢病毒系统使用pLVX-AcGFP、psPAX2、pMD2.G三质粒系统,将质粒混匀后使用磷酸钙转染方法转染至HEK293T细胞中,培养48h后,收集上清。使用genecopo公司慢病毒颗粒纯化试剂盒将慢病毒纯化。7%的琼脂糖和2xDMEM培养基在无菌试管中相混以后,再向管中加入0。纯化后留取部分检测病毒滴度,其余病毒冻存于-80℃冰箱中。

滴度检测:将病毒颗粒使用梯度稀释,分别293T细胞,72h后,在荧光显微镜下观察细胞荧光表达情况。根据细胞荧光量计算病毒滴度。

细胞:在病毒前一天对细胞进行计数,接种约10000个细胞于12孔板中,培养过夜后使用无培养基稀释病毒,加入12孔板中对细胞进行,病毒数量根据推荐细胞的MOI加入(若无推荐MOI,需做病毒梯度:1,5,10,50,100 5个梯度对细胞),6h后去除含病毒溶液,加入完全培养基细胞培养,培养48h后,在荧光显微镜下观察细胞荧光强度。同时加入puromycin对细胞筛选,筛选约2周时间。常用的染色法包括台盼蓝、橙/化乙啶(AO/EB)、Giemsa和HE法等。细胞筛选好后,使用定量PCR和Western blot检测目的基因的稳定表达情况。

实验流程:慢病毒质粒构建-HEK293T细胞培养-质粒转染293T细胞-病毒收集-病毒纯化-病毒滴度检测-细胞-稳转细胞筛选-稳转细胞鉴定

结果示例:





                                               图 A 病毒滴度检测;B 目的细胞病毒效果图


细胞培养中常见的污染及解决方法

真菌污染

真菌污染后,培养基一般清澈,保持原色。细丝可以在显微镜下观察到。,一些真菌类似于死细胞碎片,但其中许多清晰可见,看起来像珊瑚,比较容易区分。细胞检测服务作为生物体结构和功能的基本单位,细胞在机体的各项新陈代谢的生命活动中发挥着重要的作用,与此同时,细胞的生理过程,在一定程度上也是机体生命活动的反应。此外,它们会慢慢长出细细的黑色细丝,因为它们生长得比较慢,不像细菌那样容易被发现,一旦发现培养基被污染,它们将很难存活。


解决方法:一旦被真菌污染,果断丢弃,然后对细胞房、CO2 培养箱、器皿和培养基进行消毒。







选择实验外包公司需要注意哪些事项?


技术支持

尽量有专门的技术负责对接项目,或者有技术服务群。随时沟通项目问题,定期汇报实验进展。这样能把控实验进度,结果数据有疑问也可以交流,不要实验做完就没人管了。


实验数据

明确提供实验原始数据、原始图片,并有保密协议不外传数据和客户的信息。确保实验结果的完整性、唯独性、真实性。这也是找实验外包很关心的原则。另外结果尽量有实验报告形式,包含所用材料、实验步骤和结果统计分析,方便写文章时直接使用。这是由于zhongt瘤细胞自身可分泌多种生长因子,诱导血管生成。另外实验都是有不确定性的,如果外包公司能保证一定能做出预期的结果,那多半是不靠谱的。做实验不怕出问题,的外包公司会负责到底,有问题反馈再处理就好。








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