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甲l基化特异性的PCR

Herman 等（ 1996 ）在使用重亚硫酸盐处理的基础上新建的一种方法。该方法敏感性高，主要用于作定性研究。用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生jia基化的胞嘧定被转化为尿嘧ding，而jia基化的胞嘧定不变；ceRNA是目前转录调控领域的热点内容之一，通过全转录组研究能够系统性的阐述ceRNA的分子作用机制。随后设计针对jia基化和非jia基化序列的引物进行PCR。通过电泳检测MSP扩增产物，如果用针对处理后jia基化DNA链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在jia基化；反之，说明被检测的位点不存在jia基化。

特点：适用范围广，能够检测特异位点是否发生jia基化。

亚硫酸氢盐测序法（Bisulfite sequencing PCR，BSP）

亚硫酸氢盐修饰后测序法（ BSP ） Frommer 等（ 1992 ）提出的研究 DNA jia基化方法，此方法可靠性及jing确度高，能明确目的片段中每一个 CpG 位点的jia基化状态。用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生jia基化的胞嘧ding被转化为尿嘧ding，而jia基化的胞嘧ding不变。随后设计BSP引物进行PCR，在扩增过程中尿嘧定全部转化为胸腺嘧定，zui后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生jia基化，称为BSP-直接测序法。针对预测的靶蛋白结合RNA的序列设计引物，做qPCR实验，验证预测的RNA是否与靶蛋白有结合，或者将分离出来的RNA做高通量测序，筛选到可能与靶蛋白结合的RNA。将PCR产物克long至载体后进行测序，可以提高测序成功率，这种方法称为BSP-ke隆测序法。

特点：jing确度高，能够准确检测出jia基化的程度百分比。

聚合酶链式反应(PCR)

操作步骤

1.在冰浴中,按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。

1QPCR buffer

5 μl

dNTP mix( 2mM )

4 μl

引物1(10pM)

μl 2

引物2 ( 10pM)

2μl

Taq酶(2U/ul)

1 μl

DNA模板( 50ng-1μg/μl )

加ddH2O至

μl 50

视PCR仪有无热盖,不加或添加石蜡油。

2.调整好反应程序。将上述混合液稍加离心,立即置PCR仪上执行扩增。-般:在93°C

预变性3-5min ,进入循环扩增阶段: 93°C 40s→58°C 30s→72°C 60s ,循环30-35

次，后在72°C保温7min。

3.结束反应, PCR产物放置于4°C待电泳检测或-20°C长期保存。

4. PCR的电泳检测:如在反应管中加有石蜡油,需用100ul进行抽提反应混合液,以

除去石蜡油;否则,直接取5- 10μl电泳检测。

LncRNA芯片

Long non-coding RNAs（lncRNAs）是一类转录本长度超过200 nt的功能性非编码RNA分子。目前的研究已证实，lncRNA参与X染色体沉默，基因组印记以及染色质修饰，转录ji活，转录干扰，核内运输等多种重要调控过程。随着对lncRNA在哺乳动物进化及人类疾病发生和发展中作用的日益关注，lncRNA调控机制已成为当前遗传学研究的热点问题。microRNA芯片:RNA干扰(RNAInterference,RNAi)现象是一种进化上保守的抵御***或外来病毒qin犯的防御机制。

筛选出差异表达的lncRNA是研究其在人类疾病发生中所扮演角色的基础。富衡生物为用户提供高通量的lncRNA芯片进行lncRNA表达谱分析，该芯片基于Agilent的SurePrint技术生产，实验。

技术优势

信息覆盖广泛：覆盖了多个quan威lncRNA数据库发布的数据；提供人，小鼠，大鼠的lncRNA检测。

lncRNA和mRNA同时检测：芯片上包含有的lncRNA和新的mRNA序列检测探针。一次芯片实验可同时对lncRNA和mRNA进行分析。

平台成熟可靠：采用Agilent原位喷墨合成技术，了高检测灵敏度和特异性。

数据分析：提供lncRNA和mRNA表达谱差异分析和功能分析，以及二者的关联分析。

单细胞RNA测序

单细胞RNA测序也称scRNA-Seq。研究人员利用安捷伦、Illumina和NimbleGen的外显子组测序平台对同一个人类血液样品进行分析。通常而言，一般的组织细胞RNA-seq实验会产生1000万个读数，如果一个基因的频率超过50RPKM，即每百万读数中每千个碱基中超过50个，这一基因即被认为有表达。泊松分布下，1kb长的基因有超过500个读数和4%的小变异系数，即CV值；哺乳动物细胞通产含有200,000个mRNA，因此至少要用50个单细胞一起才能到达小CV值；考虑到逆转录的效率和环境干扰等因素，为得到准确的表达和细胞种类的识别，需要使用的细胞数量实际要更多。