雅安细胞实验外包承诺守信「英瀚斯」

 细胞ELISPOT检测    

     1．培养板的预处理：在24孔培养板内加0.5ml 0.2%戊er醛，37℃，4h，弃掉板中的处理液，用PBS洗涤3次，每次3min；

     2．抗原包被：将适量抗原溶于包被缓冲液中，每孔加入0.5ml，4℃过夜，PBS-T洗涤3次，每次3min；

     3．制备细胞悬液：将待测已致敏小鼠处死，取出pi脏，置于加有Hanks液的平皿内，用钝头直角9号zhu射器针头破少许脾被膜后，赶出细胞，用毛细吸管轻轻吹散细胞团后，将悬液通过250目尼龙网，取滤液，1000r/min离心5min，Hanks液洗涤3次，计数细胞后，用1640液重新悬浮细胞，配成所需浓度；说明密度梯度离心法联合差速贴壁法可在体外有效分离培养大鼠骨sui内皮祖细胞。

     4．往各孔中加入0.5ml含不同浓度（104-106/ml）的细胞悬液，置37℃，5％CO2条件下孵育2-4h，弃掉培养液，PBS-T洗涤3次，每次3min；

     5．往各孔中加入0.5ml生物素化抗ti（Bio-Ab）（2μg/ml），37℃孵育1h或4℃过夜，弃掉液体，PBS-T洗涤3次，每次3min；

     6．加入辣根过氧化物酶结合的亲合素（Avi-HRP）（2μg/ml），37℃孵育30min，弃掉液体，PBS-T洗涤3次，每次3min；

     7．配制明胶-底物液：在37℃水浴中，将2.5mlTMB溶液（4mg/ml  jia醇溶液）滴加入7.5ml10%明胶溶液（用pH5.0磷酸钠-柠檬酸缓冲液配制）边加边搅，溶液呈白色，加入14μl 3% H202；

     8．显色与计数：将培养板底冰浴，每孔加入0.6ml明胶-底物液，约3min，混合液凝固，将培养板取出，置室温5min，将板倒置，用肉眼和低倍放大镜计数所显示出的颜色的斑点。

大鼠gu髓间充质gan细胞的分离

操作方法

(1 )取SD大鼠( 2周龄)，颈椎脱臼法处死后立即用75%乙醇浸泡，移入超净工作台内，用大头针固定大鼠四肢于工作台面的泡沫板上。

(2)碘酒擦拭四肢，再用酒精棉球擦拭，无菌条件下用灭菌消毒后的镊子和剪刀分离出大鼠股骨和胫骨，剔除骨头表面肌肉, PBS溶液冲洗两遍。

(3 )从中间剪断股骨和胫骨，用2ml无菌注she器吸取DMEM/F 12溶液冲出gu髓细胞多次，再用针头吹打，吸管吸入离心管内，1000r/min离心5min，弃上清，用PBS重悬细胞。

(4 )缓慢将细胞悬液加入预先装有5mL淋巴细胞分离液的15mL离心管内，保持细胞悬液在淋巴细胞分离液上层，注意不要搅动液面,保持二者分层界面。

(5 ) 2000rpm离心15-25min，离心后溶液分4层，吸取中间骨sui基质细胞层(白色浑浊状)， PBS洗三次。

(6)用含15%胎牛xue清及青链mei素的DMEM/F 12以106/mL的细胞浓度接种于25cm2培养瓶中， 置37°C、5%CO2恒温培养箱中培养。

( 7 ) 24小时后弃去培养液(看细胞贴壁情况)，PBS冲洗2-3次去除末贴壁细胞，加入培养液继续培养。以后每3d半量换液1次，-般10d细胞生长融合。

(8 )经0.25%胰酶消化，1 : 2传代，其后一般3-5d传代1次,选取生长良好的第三代细胞进行后续实验。

细胞冻存有哪些注意事项？

细胞培养的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费，而且细胞一旦离开开始原代培养，它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。因此,3D多细胞肿liu球培养模型已经逐渐应用于gan细胞培养和分化、ai症研究、yao物和毒性筛选及组织工程等特定应用中。因此及时进行细胞冻存十分必要。细胞冷冻储存在-70℃冰箱中可以保存一年之久;细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是的。

细胞冻存的步骤：

配制含 10%DMSO 或甘油、10~20% 小牛的冻存培养液;

取对数生长期的细胞，去除旧培养液，用 PBS 清洗。

去除 PBS，加入适量胰蛋白酶 (覆盖培养皿表面) 把单层生长的细胞消化下来;

离心 1000rpm，5min;

去除胰蛋白酶，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的终密度为 5×106/ml~1×107/ml;

将细胞分装入冻存管中，每管 1~1.5 ml;

在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者;

冻存:标准的冻存程序为降温速率-1~-2℃/ min;当温度达-25℃以下时，可增至-5℃~-10℃/min;到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。无论原发性zhong瘤还是继发性zhong瘤，一旦生长直径超过1~2mm，都会有血管生成。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱 2h ，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。