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发布时间:2022-06-07 00:45:00 作者:英瀚斯
RNA提取
1.弃去培养液,用PBS清洗两次1-2。
2.弃去PBS,用1000u1吸干净残余PBS。
3.加1ml TRIZOL研磨B 41。
4. 1.5mIEP管标号与每孔相对应备用。
5.研磨好的溶液转移至对应的 EP管中国。
6.往每个EP管中加入250ul,剧烈震荡30s, 冰上静置12min[问l。
7. 所有样品4C离心,转速: 13500转1分钟,时间: 15min.
8. 再次标记一批同样编号EP管。
9.离心后吸上清液400u1移入相应编号的EP管中,再加入400ul异充
分混匀。4C冰箱35min。
10. 4C离心,转速: 13500转1分钟,时间: 10min.
11.弃去.上清液,加1m175%乙醇,轻摇7]。
12. 4C离心,10600转/分钟,时间: 5min.
13. 弃上清液滤纸吸干。
14. 加DEPC水10ul溶解,-80C保存。进行逆转录前测浓度。
组织RNA提取
1、剪米粒大小组织块放入EP管中标号。
2、EP管中加300ul trizol浸泡30分钟或更久。
3、用研磨棒研磨,以肉眼很难看到组织为宜。
4、加700u1 trizol静 置5分钟。
EMSA实验
EMSA:凝胶迁移或电泳迁移率检测是一种检测蛋白质和DNA序列相结合的技术,初用于研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用,可用于定性和定量分析。分为2种类型:同位素标记探针,非同位素标记探针。
通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温,在非变性的聚bing烯凝胶电泳上,分离复合物和非结合的探针。DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同,可是双链或者是单链。当检测如转录调控因子一类的DNA结合蛋白,可用纯化蛋白,部分纯化蛋白,或核细胞抽提液。在检测RNA结合蛋白时,依据目的RNA结合蛋白的位置,可用纯化或部分纯化的蛋白,也可用核或胞质细胞抽提液。竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RN片duan和gua核苷酸片段(特异),和其它非相关的片段(非特异),来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。分子实验介绍——荧光检测细胞荧光染色是以荧光物质标记而进行抗原定位的技术。在竞争的特异和非特异片段的存在下,依据复合物的特点和强度来确定特异结合。
25.PCR扩增不出就引物有问题吗?
答:基本不是。当今发展出各色各样的PCR扩增技术,各色各样的高温聚合酶,就是来解决PCR扩增中遇到的扩不出、扩增效率低的问题。如巢式PCR就是扩增那些拷贝数很低的基因片段。目前主要使用Sybrgreen和taqman法对RNA含量进行检测。 有些重复片段的扩增, GC含量高的片段,非要采用特殊扩增手段才能扩增出了。
引物扩增不出,主要是下列两种情况比较常见:
(1) RT-PCR。请注意,很多基因通过常规RT -PCR方法是很难扩增出来的。 RT- PCR成功的关键在于RT的反应的RNA质量和目标基因在特定组织和细胞中含量。
(2)从基因组中扩增。一般情况下,基因在基因组中都是单拷贝,基因组作为模板需要严格控制用量。基因组DNA过高,会影响反应体系中的Mg和pH
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