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发布时间:2022-05-25 05:42:00 作者:英瀚斯
蛋白提取
大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液, 少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丁醇等有ji溶剂中,因些,可 采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。
(一)水溶液提取法
稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质常用的溶剂,通常用量是原材料体积的1-5倍,提取时需要均匀的搅拌,以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。研究人员还比较了同一样品的外显子组测序和全基因组测序(WGS),显示外显子组测序能够检测到WGS错过的小变异。一方面,多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大,因此,温度高利于溶 解,缩短提取时间。但另一方面. ,温度升高会使蛋白质变性失活,因此,基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温( 5度以下)操作。为了避免蛋白质提以过程中的降解,可加入蛋白 水解酶抑zhi剂(如二yi丙基氟磷酸,碘yi酸等)。
注意事项
1. 为了避免蛋白质变性,不要对样品剧烈搅动和反复冻融。
2. 缓冲溶液成分尽量模拟细胞内环。。
3. 为了避免蛋白质的氧化,将 0.1~1 mmol/LDTT(二硫苏糖醇)(或 β-巯)加入到缓冲溶液中。
4. 为了避免重金属对目标蛋白的破坏,将 1~10 mmol/LEDTA 金属螯合剂加入。
5. 为了避免微生物生长,使用灭菌溶液。在纯化任何一种蛋白质的时候,均必须时刻对它的稳定性注意维护,使它的活性得到保护,需要牢记如下一些通用的注意事项。
6. 尽可能置于冰上或者在冷库内进行操作。
7. 蛋白浓度不要太稀。
8. 除非是进行聚焦层。否则 pH 需要合适,防止所使用的缓冲溶液 pH 与 pI 相同,使蛋白质的沉淀得以避免。
9. 使用蛋白酶,避免蛋白酶对目标蛋白的降解;在纯化细胞中的蛋白质时,将 DNA 酶加入来使得 DNA 降解,避免 DNA 对蛋白的污染。
2.引物纯化方式有哪些,如何选择?
◆ 脱盐
寡核苷酸合成后,为了纯化寡核苷酸成为天然的DNA结构,首先必须去除保护基团。通过浓氨水处理,合成的寡核苷酸从固相载体上分离,2-乙氧基--磷酸二脂键的保护基团,以及碱基的保护基团基(苯甲酰基和异丁基)被去除,从而形成了天然的DNA结构。然而,必要的去保护步骤完成后,寡核苷酸混合物还包含几种必须被去除的小分子有机化合物。miRNA在物种进化中相当保守,在动物、植物和真菌等中发现的miRNA表达均有严格的组织特异性和时序性。所有非必须有机化合物被移除的过程通常叫做脱盐。脱盐纯化可以借助反向硅胶柱进行。尽管脱盐纯化可以移除所有的非必须有机杂质,但它不能有效移除合成中产生微量的提前终止的寡核苷酸杂链。然而,脱盐的寡核苷酸还是能够满足PCR检测等基础生物研究。
◆ BioRP / OPC纯化
如果寡核苷酸以“三苯”的形式合成,则N-寡核苷酸包含5’-DMT基团,提前终止的寡核苷酸不包含该基团。银染法对凝胶进行染色(1)固定(2)清洗(3)增敏(4)清洗(5)染色(6)清洗(7)显影(8)定影(9)水洗3。因为DMT基有强的亲脂的特性,有5’-DMT基团的寡核苷酸与反相树脂有亲和性,因此反相亲和树脂通常被用于寡核苷酸的纯化。利用反向树脂和5’-DMT寡核苷酸存在强亲和力,但是提前终止的寡核苷酸不包含DMT基团,所以,我们能够成功的把想要的N-寡核苷酸从提前终止的寡核苷酸杂质中分离出来。
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