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分子实验介绍——印迹（Western blot）检测

通过SDS-PAGE凝胶将细胞或生物样品内的蛋白按照蛋白分子量从大到小规律分离开。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如纤维素薄膜或PVDF膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的起反应，再与酶或同位素标记的第二起反应（目前主要用HRP标记的第二），经过底物显色或自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分（目前主要使用鲁米诺和二抗中的HRP反应发出荧光，通过仪器或者胶片显色）。目前常用的RNA干扰手段为miRNA、shRNA和siRNA等。该技术广泛应用于检测蛋白水平的表达。

实验流程：细胞收集-细胞裂解，蛋白提取-蛋白变性-SDS-PAGE电泳-蛋白质转膜印记-蛋白封闭-目的孵育-二抗孵育-显色拍照

结果示例：

图 A不同大小的质粒转染细胞后，Western blot检测图片；B A蛋白不同培养时间后Western blot检测图片；C 使用Image pro plus软件对A蛋白灰度检测，A蛋白表达变化统计图

转录组测序

转录组即某个物种或特定细胞在某一功能状态下产生的RNA的总和，是研究细胞表型和功能的一个重要手段。与基因组不同的是，转录组的定义中包含了时间和空间的限定。同一细胞在不同的生长时期及生长环境下，其基因表达情况是不相同的。转录组测序（RNA-Seq）是指利用第二代高通量测序技术进行cDNA测序，快速地获取某一物种特定qi官或组织在某一状态下的转录本。外显子测序外显子组测序（exome-seq）是对定向富集的基因组DNA进行高通量测序，它能够以相对低的费用对人类外显子组进行拷问。相对于传统芯片而言，RNA-Seq无需预先设计探针，即可对物种的细胞类型的转录组进行检测，能够提供较的数字化信号，更高的检测通量以及更广泛的检测范围，是目前深入研究转录组复杂性的良好工具。

分子与质粒载体构建

实验原理

外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下,有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠DNA连接酶。两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有—种大肠连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。全转录组测序全转录组是指特定组织或细胞在特定状态下所有转录产物的总和，包括mRNA和各种noncodingRNA。但这种连接的效率比粘性末端的连接效率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。

T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反应分为3步：，T4DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶—AMP复合物；然后，酶—AMP复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。

DNA重组的方法主要有粘端连接法和平端连接法，为了防止载体本身的自连，可以通过(牛碱性磷酸酶)CIP处理克服。

连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性.但是在这个温度下，粘性末端的氢键结合是不稳定的。因此人们找到了一个折中温度，即12-16℃，连接12-16h(过夜)，这样既可大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。

22.同样的OD用PAGE检测，EB染色为什么深浅不一？

答：通常可以用EB染色的方法来判断双链DNA的量(如质粒DNA)，因为EB可以嵌合到双链DNA中。而合成的单链DNA，由于碱基组成不同，形成二级结构的可能性不同，EB的染色程度也会有差异，比如Oligo(dT)等不形成二级结构，EB染色效果就非常差。所以不要用EB染色的方法来定量，而用紫外分光光度计检测。于是,我们把位于染色体上某一区域的一组相关联的SNP等位位点称作单体型(haplotypeb大多数染色体区域只有少数几个常见的单体型(每个具有至少5%的频率),它们代表了一个群体中人与人之间的大部分多态性。同样道理，用EB染色来照片不适合所有引物。

23.引物不纯会有什么后果？

答：引物不纯可能会导致：1)非特异性扩增；2)无法用预先设计在引物5′端酶切位点的酶切开，特别是没有保护碱基的引物；3) 用于测序出现双峰或乱峰。解决办法重新合成或重新纯化。

24.已经溶解的引物，为什么原先使用正常，而过一段时间再使用就不好了？

答：如果溶解引物的水PH过低或污染了菌或核酸酶，会使引物降解。使用时没有充分解冻混合，液体不均匀也可能会造成引物加入量不准确。建议分装引物，避免反复冻溶。建议使用10mMT ris pH7.5缓冲液溶解引物，因为有些蒸馏水的pH值比较低（pH4-5）, 引物在这种条件下不稳定。如今有多家公司推出了外显子组捕获试剂，包括罗氏NimbleGen、安捷伦、Illumina，还有现在的华大基因。还有一种可能性是引物没有问题，而是PCR使用材料特别是模板的质量与先前使用的不完全一致。