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三、自噬过程进行观察和检测

1、观察自噬体的形成

由于自噬体属于亚细胞结构，普通光镜下看不到，因此，直接观察自噬体需在透射电镜下。Phagophore的特征为:新月状或杯状，双层或多层膜,有包绕胞浆成分的趋势。一般流程：细胞收集-PI-AnnexinV标记-流式细胞仪检测。自噬体(AV1 )的特征为:双层或多层膜的液泡状结构，内含胞浆成分，如线粒体、内质网、核糖体等。自噬溶酶体(AV2 )的特征为:单层膜，胞浆成分己降解。( autophagic vacuolo AV )

2、在荧光显微镜下采用GFP-LC3融合蛋 白来示踪自噬形成由于电镜耗时长，不利于监测(Monitoring) 自噬形成，人们利用LC3在自噬形成过程中发生聚集的现象开发出了此技术。分选后的细胞能直接用于培养、移植、核酸提取、单细胞PCR扩增或原位杂交等，可进一步进行细胞基因、蛋白、功能水平的研究和不同细胞之间的差异化研究。无自噬时，GFP-LC3融合蛋 白弥散在胞浆中;自噬形成时，GFP-LC3融合蛋白转 位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。

3、利用Western Blot检测LC3-II/比值的变化以评价自噬形成自噬形成时，胞浆型LC3 (即 LC3-I)会酶解掉一小段多肽，转变为(自噬体)膜型(即LC3-ID，因此，LC3-II/比值 的大小可估计自噬水平的高低。(注意: LC3对LC3-II有更高的亲和力，会造成假阳性。细胞诱导是指将一群不同类型或者形态结构、功能特征存在差异的细胞通过生物学、物理学等手段，将之转变为具有相似/相同形态结构、功能特征的细胞群体的过程。方法2和3需结合使用，同时需考虑溶酶体活性的影响。)

4、MDC (Monodansylcadaverine ，单丹磺酰尸胺)染色:包括自噬体，所有酸性液泡都被染色，故属于非特异性的。

5、CellTrackerTM Green染色:主要用于双染色，但其能染所有的液泡，故也属于非特异性的。

细胞传代培养

操作步骤

1.将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。

2、加入0.5- -1ml 0.25%胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。

3、瓶口塞好橡皮塞，放在倒置镜下观察细胞。随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时将胰酶弃去，加入10m培养液终止消化。2%的琼脂糖和2xDMEM培养基(含有2x和20%的小牛血l清)混合后，取3mL混合液注入直径6cm平皿中(10cm平皿加7~10mL)，冷却凝固，可作底层琼脂置CO2温箱中备用。观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细zhen孔空隙时终止消化。一般室温消化时间约为1- -3分钟。

4、用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另外两到三瓶中，实践培养液塞好橡皮塞，置37°C下继续培养。第二天观察贴壁生长情况。

附:消化液配制方法:

称取0.25克胰酶蛋白酶(活力为1 : 250)， 加入100ml无Ca2+、Mg2+的Hank's液溶解，滤器过滤chu菌，4°C保存,用前可在379C下回温。胰酶溶液中也可加入EDTA，使zui终浓度达0.02%。

细胞冻存有哪些注意事项？

细胞培养的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费，而且细胞一旦离开开始原代培养，它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。因此及时进行细胞冻存十分必要。细胞实验介绍——慢病毒建立稳转细胞系慢病毒包装：公司使用3质粒慢病毒包装系统，慢病毒系统使用pLKO。细胞冷冻储存在-70℃冰箱中可以保存一年之久;细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是的。

细胞冻存的步骤：

配制含 10%DMSO 或甘油、10~20% 小牛的冻存培养液;

取对数生长期的细胞，去除旧培养液，用 PBS 清洗。

去除 PBS，加入适量胰蛋白酶 (覆盖培养皿表面) 把单层生长的细胞消化下来;

离心 1000rpm，5min;

去除胰蛋白酶，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的终密度为 5×106/ml~1×107/ml;

将细胞分装入冻存管中，每管 1~1.5 ml;

在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者;

冻存:标准的冻存程序为降温速率-1~-2℃/ min;当温度达-25℃以下时，可增至-5℃~-10℃/min;到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。(4)再次用PBS缓冲液冲洗3次，滤干，将细小的软gu块置入放有0。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱 2h ，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。